一．病毒RNA樣品提取
Real-time RT-PCR實驗的第一步是獲得純凈的RNA樣品，檢測H1N1病毒的呼吸道樣本包括支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物、痰、鼻咽或口咽洗液或拭子。而在流行病爆發時，能夠對大批樣品進行快速而安全的提取非常重要。ThermoFisher公司的KingFisher系列自動化磁珠提取純化儀器，聯合Ambion等公司的病毒RNA磁珠提取試劑盒，可以用于從多種來源的樣本中，如血清、血漿、口腔拭子和細胞培養液中，提取病毒RNA。該系統不需有機溶劑或RNA沉淀步驟，消除了基于濾膜的方法經常碰到的問題，如濾膜堵塞、大的洗脫體積和不穩定的產率。KingFisher可以讓操作人員免去很多繁瑣的手工操作，并且遠離病毒及有毒試劑的危害。而結合后續的實時定量RT-PCR，可儀檢測到低至10拷貝的病毒RNA，可極大提高H1N1亞型豬流感病毒檢測的靈敏度。
此技術經過美國國家獸醫服務實驗室（NVSL）驗證，是美國農業部認可的禽流感檢測的分子生物學方法。目前，日本的國立傳染病研究所剛剛購買了4臺新推出的Kingfisher Flex，應用于流感病毒RNA的純化。韓國的Catholic University 也剛剛采購了Kingfisher mL用于病毒RNA的應用。越南的Kingfisher安裝在世衛組織（WHO）的實驗室。中國農業部獸醫診斷中心、哈獸研動物流感參考實驗室、北京出入境檢驗檢疫局 等單位，以及澳大利亞和新西蘭的Kingfisher系統也主要應用于這方面的工作。
二．Real-time RT-PCR檢測
Real-time RT-PCR是目前最快速最靈敏的病毒檢測方法之一，也是《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測方法》中推薦使用的方法。Real-time RT-PCR檢測豬流感的方案是用一組寡聚核苷酸引物和Taqman探針，對呼吸道樣本或體外培養的豬流感病毒進行檢測鑒定。InfA引物和探針為檢測出甲型流感病毒而設計，swInfA引物和探針可特異性地檢測出所有的豬甲型流感病毒，swH1引物和探針可特異性檢測豬流感病毒H1亞型。因為實驗材料是RNA，所以推薦使用一步法反轉錄熒光定量PCR試劑盒。
美國Bio-Rad作為全球分子生物學實驗室設備領域的領先者，對于流行病致病菌和病毒的檢測一直非常關注。美國CDC/WHO 關于豬流感檢測的文獻和操作方法中，使用了Bio-Rad的一步法熒光定量PCR試劑盒iScript One-Step RT-PCR Kit，及Bio-Rad的熒光定量PCR儀。
美國Bio-Rad的CFX96 實時定量PCR儀，能夠為使用者提供可靠的溫度控制特性、最先進的光學檢測技術和功能強大的軟件控制及數據分析能力，能夠得到精確的定量結果，準確區分目標基因。為研究者提供最佳的實時定量PCR結果。
CFX96 Touch實時定量PCR儀的主要特點
n 結果可靠——光源和檢測器采用一體化的光梭，長壽命的LED和光敏二極管整合在一起，確保實驗結果可靠；
n 快速得到實驗結果——光學系統出廠時即經過嚴格校正，
儀器即插即用，能夠在數分鐘內完成安裝，開始實驗
n 縮短實驗運行時間——快速的升降溫速度，
能夠在30分鐘內完成定量PCR 實驗
n 快速優化實驗條件——溫度梯度功能能夠在一次實驗中既能找到最優化的實驗條件
n 減少實驗樣品和試劑的消耗——10 μl反應體系即能得到穩定可靠的實驗結果
n 根據實驗需要選擇數據采集方法——支持SYBR Green 快速掃描模式
n 隨時隨地分析實驗結果——軟件能自動通過電子郵件將實驗結果作為附件發送
n 提高檢測通道——一臺電腦能夠控制多大4臺CFX96 Touch 實時定量PCR 儀
美國Bio-Rad的一步法熒光定量PCR試劑盒iScript One-Step RT-PCR Kit，融合了iScript反轉錄酶系統和iTaq熱啟動DNA聚合酶系統，非常適用于病毒的快速檢測，是美國CDC2007年推薦的檢測豬流感的標準Protocol中采用的試劑盒。
iScript One-Step RT-PCR Kit的主要特點：
n 可兼容所有雜交探針進行靈敏和特異性的RT-PCR
n 線形動態范圍從100fg到100ug，使客戶的實驗設計
具備很大的靈活性，可靠檢測低拷貝的目標序列。
n 整個試劑盒只有優化過的三管成分，操作簡便。
流水線化的反應組裝程序，有效減少實驗操作和試劑分裝步驟中引入交叉污染的幾率。
n 獨特的低起泡配方，減少加樣過程中帶來的氣泡，使高通量和自動化實驗中的組裝步驟變簡單。
n 經驗證，可對樣品中拷貝數接近的兩個目標序列進行同時檢測。
三．樣品操作與保存
《甲型H1N1流感病毒實驗室檢測方法》中要求樣品處理要在生物安全實驗室完成。生物安全實驗室需要配備相應的生物安全柜對實驗室環境、操作人員及樣品進行保護。美國熱電 Thermo Fisher旗下的 A2/B2型生物安全柜是世界上最好的生物安全柜，在國際上享有很好的盛譽。美國熱電的生物安全柜（包括部分棑和全棑）都，達到Class 2等級，工作區氣流潔凈度達100級。此外，同屬Thermo Fisher旗下的Forma系列-80℃超低溫冰箱能夠為樣品提供最好的保存環境與保護，Forma系列液氮罐更可以用于有生物危險性的樣品的運輸。